近日、Yaoyi Li等人在Cell Research期刊发表了“R-loops orchestrate RNAPII transcriptional reprogramming forthe maternal-to-zygotic transition”的论文，本研究首次系统揭示了R-loop（三链RNA-DNA杂合结构）在小鼠着床前胚胎发育中的动态变化、分子机制及其关键功能，提出一类新型的“CG-poor R-loops”（或称AT-rich R-loops）作为“发育计时器”，通过精确调控RNA聚合酶II（RNAPII）的“暂停-释放”转换，驱动母体到合子转录程序的转换（MZT）。
摘要：
R环是普遍存在的基因组结构，能够连接表观遗传修饰与转录调控。然而，在哺乳动物胚胎着床前发育过程中，R环的功能作用及其调控机制仍未被探索。本研究揭示，R环在不同发育阶段的重编程过程依赖于CG密度：CG贫乏型R环具有更强的阶段特异性，并与早期胚胎发育密切关联。CG贫乏型R环的缺失会导致母源-合子转换（MZT）及胚胎着床前发育出现严重缺陷。这类R环的异常维持会促使主要合子基因组激活（ZGA）基因过早激活。CG贫乏型R环通过抑制7SK/HEXIM1 snRNP复合物中DDX21解旋酶的活性，限制CDK9的释放及其后续对RNA聚合酶II C端结构域Ser2位点的磷酸化（RNAPII S2p）——这是转录暂停解除的关键生化标志——从而促使RNA聚合酶II在主要ZGA基因启动子区域聚集，确保高效转录。这些发现确立了R环作为RNA聚合酶II暂停释放的直接调控因子，在母源-合子转换过程中保障基因表达的时序精确性。
研究背景：
R环是由RNA:DNA杂合链和一条被置换的单链DNA组成的三链核酸结构，目前已被确认为普遍存在的基因组特征，在细胞生理和疾病中具有环境依赖性作用。程序性R环在转录终止和基因表达中发挥关键作用，但其失调与疾病、发育异常以及细胞稳态破坏有关。
近期研究进展将R环表征为具有不同序列背景的表观遗传调控因子。富含CG的R环常由G-四链体（G4）结构稳定，富集于活跃启动子区域，并通过招募DNA去甲基化酶促进转录激活。然而，在酵母和拟南芥中大量存在的贫乏CG的R环与转录关联甚微，其功能特异性尚不明确。序列特异性的R环是否在哺乳动物早期胚胎发育或细胞命运决定过程中调控不同的转录程序，仍有待阐明。
哺乳动物着床前胚胎发育为研究R环在极端转录重编程背景下的功能提供了独特模型。受精后，胚胎经历母源-合子转换（MZT），该过程需要合子基因组激活（ZGA）与母源转录本清除的精确协调。RNA聚合酶II（RNAPII）经历预配置，在主要ZGA基因处从暂停状态转变为进行性延伸，但R环是否参与调控RNAPII动态尚不清楚。
早期哺乳动物胚胎面临独特挑战，包括独特的表观遗传重编程轨迹和非经典的表观基因组模式。由于R环与众多表观基因组和基因调控事件相关，需要高分辨率方法来解析R环动态及其对转录调控的机制贡献。然而，R-loop图谱技术（包括基于S9.6和基于HBD的方法）在低起始量背景下灵敏度有限，且存在交叉反应问题。低起始量胚胎材料分析的技术限制，加上发育过程中R环的瞬时性，阻碍了早期胚胎发育中R环生物学的深入研究。我们近期开发的核酸酶辅助R环鉴定与测序技术克服了这些限制，通过酶切消化与高通量测序相结合实现了精准检测。
本研究将RIAN-seq技术适配于微量起始材料，实现了小鼠着床前胚胎发育过程中R环的高分辨率图谱绘制。我们揭示R环作为胚胎发育的关键调控因子，其CG密度区分了功能不同的R环类型。富含CG的R环在发育阶段间共享，而贫乏CG的R环通过在晚期2细胞期（L2C）前促进RNAPII在启动子处的积累，确保主要ZGA基因的RNAPII进行性转录。贫乏CG的R环缺失会破坏MZT，导致47.47%的主要ZGA基因下调，40.72%的母源转录本异常持续存在，并伴随胚胎发生受损。贫乏CG的R环通过抑制7SK/HEXIM1 snRNP复合物上的DDX21解旋酶活性，限制CDK9释放，并通过维持RNAPII羧基末端结构域（CTD）Ser2位点的低磷酸化状态，防止RNAPII暂停过早释放。这些发现挑战了将R环视为转录副产物的范式，而是将其定位为RNAPII进程性的调控因子。作者提出一个模型：R环的CG密度编码了功能指令，引导RNAPII通过发育检查点。
文章论证过程：
1. R-loop的发育动态图谱：研究者开发了超灵敏、低细胞数需求的 RIAN-seq 技术，首次绘制了小鼠配子及早期胚胎全基因组R-loop动态图谱。数据揭示了一类富含AT（CG-poor）的R-loops在早期胚胎中广泛存在，而GC-rich的R-loops则更为稳定并跨阶段遗传。
2. “CG-poor R-loops”作为关键调节子：功能实验表明，R-loop是胚胎发育所必需的。全局敲低R-loop（通过过表达RNase H1）导致胚胎发育阻滞在1-8细胞期，囊胚形成率显著下降。更重要的是，通过 dCas9-RNase H1靶向技术 特异性清除特定基因启动子区的CG-poor R-loops（而非CG-rich R-loops），会显著抑制下游合子基因组激活（ZGA）基因的表达，证明此类R-loop具有特异性的调控功能。
3. 核心分子机制：研究阐明了CG-poor R-loops调控转录的精确路径。
● 抑制DDX21解旋酶：生化与质谱分析发现，AT-rich R-loops能够抑制DDX21解旋酶对7SK/HEXIM1 snRNP复合体的活性。
● 调控CDK9释放与RNAPII磷酸化：DDX21被抑制后，导致CDK9（正性转录延伸因子P-TEFb的关键激酶）从7SK复合体中释放减少，进而调节RNAPII C端结构域（CTD）第2位丝氨酸（Ser2）的磷酸化（S2P）水平。
● 时空精准调控转录：在早期2-细胞期，CG-poor R-loops通过上述机制维持RNAPII在ZGA基因启动子区处于暂停状态（低S2P），防止其过早释放和转录。在晚期2-细胞期，这些R-loops被适时移除，DDX21激活，触发CDK9大量释放和RNAPII S2P的爆发性磷酸化，从而驱动ZGA基因的协同激活。同时，R-loops通过滞留RNAPII在母体基因启动子区，促进母体转录本的沉默。
4. 表型证据：R-loop的失调直接导致转录程序混乱。全局敲低R-loop后，约47.5%的ZGA基因激活被抑制，同时约40.7%的母体RNA降解延迟。RNAPII S2P的磷酸化动态也出现异常：早期异常升高，晚期则不足，破坏了转录延伸的正常节律
研究亮点：
1. 序列组成决定早期植入前发育过程中R-环的稳定性
2. 在合子基因组激活期间，CG含量低的R-环强制维持主要ZGA基因启动子区域的RNA聚合酶II富集
3. CG含量低的R-环对小鼠植入前发育至关重要
4. 低CG含量的R环促进母源-合子转换（MZT）
5. 低CG含量的R环通过抑制RNA聚合酶II在Ser2位点的磷酸化，防止其在母源-合子转换期间过早释放暂停状态
6. R环通过抑制DDX21，将7SK/HEXIM1 snRNP复合物锚定于基因启动子区域，从而驱动母源-合子转换
研究总结：
在合子基因组激活前阶段，低CG含量R环通过抑制DDX21解旋酶在主要ZGA基因位点对7SK/HEXIM1 snRNP复合物的作用，聚集RNAPII并维持CDK9处于失活状态。至晚期2细胞阶段，DDX21介导的R环解离后，其与7SK/HEXIM1的结合增强，进而促进CDK9释放，最终激活主要ZGA基因。低CG含量R环的缺失会导致早期胚胎发育异常及母源-合子转换期间的基因表达紊乱。
参考文献：Li, Y., Li, Q., Wang, X. et al.R-loops orchestrate RNAPII transcriptional reprogramming for the maternal-to-zygotic transition. Cell Res(2026). https://doi.org/10.1038/s41422-025-01208-2
