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四川大学贾知军团队 JACS Au 重编程亚胺还原酶用于富电子烯酰胺的对映选择性还原

2026-08-26 05:59:08

本研究成功对一种来源于中华根瘤菌的亚胺还原酶进行“重编程”，使其能够高效、高选择性地催化还原原本难以反应的“富电子烯酰胺”。该研究通过定向进化技术对酶进行改造，最终获得的优化酶变体能够合成多种手性胺类化合物，最高产率达97%，对映选择性超过99:1。机理研究表明，该反应通过一种新颖的“烯胺-亚胺互变异构”机制进行。这项研究打破了亚胺还原酶催化功能的界限，为绿色、高效合成手性胺类药物中间体提供了强大的新工具。

研究背景

手性胺结构是众多药物分子和精细化学品的核心骨架，其高效、绿色合成一直是化学家追求的目标。亚胺还原酶是一类依赖NADPH辅酶的生物催化剂，因其能高效、高选择性地还原亚胺合成手性胺而备受关注。近年来，科学家们致力于拓展IREDs的催化能力，使其能够还原C=O键、共轭还原缺电子C=C键，甚至用于光酶催化反应。然而，对于直接还原“富电子”的C=C键（如烯酰胺），由于缺乏有效的生物活化策略，始终是一个巨大的挑战。传统方法主要依赖贵金属配合物和高压氢气，存在成本和环境不友好等问题。

研究问题

能否打破自然酶催化的限制，开发一种无需光激活、直接还原富电子烯酰胺的生物催化方法？研究团队从有机小分子催化中获得灵感：布朗斯特酸可以促进烯胺-亚胺互变异构，生成高活性的亚胺中间体。他们提出核心假设：能否在亚胺还原酶的活性中心模拟这一过程，通过酶促的互变异构活化烯酰胺，进而利用IREDs固有的亚胺还原能力，实现烯酰胺的对映选择性还原？

研究方案

1. 酶库筛选与起点确定：团队首先筛选了包含200多种野生型IREDs的酶库，最终选定来自中华根瘤菌的SinIRED作为起点，其对模型底物初步显示出6%的转化率和>99:1的对映选择性。

2. 定向进化优化酶活性：利用AlphaFold2生成酶结构模型并进行分子对接，锁定活性中心附近的关键氨基酸位点。通过多轮定点饱和突变筛选，最终获得一个五重突变体 SinIRED-V5，其催化效率显著提升。

3. 反应条件优化：使用纯化后的SinIRED-V5酶，系统优化了酶用量、缓冲液pH、反应时间等参数，最终将模型反应的产率提升至78%。

4. 底物普适性考察：在最优条件下，测试了多种不同结构的烯酰胺底物，证明了该生物催化体系具有广泛的底物适应性。

5. 机理验证：通过氘代标记实验、β-支链底物反应以及关键活性位点突变等手段，深入揭示了反应机理。

05 研究结论与创新点

1. 广阔底物范围：该生物催化系统对带有不同取代基的芳香族、杂环（如噻吩）以及环状烯酰胺都具有良好的兼容性，能够以优异的对映选择性得到相应的手性胺产物。值得一提的是，产物 2l 和 2m 分别是重磅药物雷沙吉兰和去甲舍曲林的关键中间体，展示了其巨大的应用潜力。

2. 新颖反应机理：机理研究证实，反应并非直接还原C=C键，而是遵循一个两步协同机制：首先，酶活性中心的氨基酸D171作为质子供体，质子化烯酰胺的β-碳，使其发生烯胺-亚胺互变异构，生成亚胺中间体；随后，NADPH提供的氢负离子对亚胺的α-碳进行立体选择性加成，最终得到还原产物。该机理完美解释了氘代实验中氘原子在α位和β位的标记位置。