一张总路线图

Python 基础分析：Scanpy 是主线

如果说 Seurat 是 R 语言单细胞分析的经典入口，那么 Scanpy 就是 Python 单细胞分析的主线。它的核心数据对象是 AnnData：表达矩阵放在 .X，细胞信息放在 .obs，基因信息放在 .var，降维和邻接图结果放在 .obsm、.uns、.obsp 中。初学者只要理解 AnnData，就抓住了 Python 单细胞的骨架。

1.读取数据：10x 的 matrix.mtx.gz、features.tsv.gz、barcodes.tsv.gz，或直接读取 .h5ad。

2.质控：过滤低基因数细胞、高线粒体比例细胞、低表达基因，必要时识别 doublet。

3.标准化：每个细胞归一化到相同总 counts，再 log1p 转换。

4.筛选高变基因：保留最能解释细胞差异的基因。

5.降维聚类：PCA → 邻接图 → Leiden/Louvain 聚类 → UMAP/t-SNE 可视化。

6.注释细胞类型：marker 基因人工判读，或 CellTypist 自动注释辅助。

import scanpy as scadata = sc.read_10x_mtx("filtered_feature_bc_matrix/", var_names="gene_symbols")adata.var_names_make_unique()adata.obs["mt_frac"] = adata[:, adata.var_names.str.startswith("MT-")].X.sum(1).A1 / adata.X.sum(1).A1sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=200)sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3)adata = adata[adata.obs["mt_frac"] < 0.15].copy()sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)sc.pp.log1p(adata)sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=3000)adata = adata[:, adata.var["highly_variable"]].copy()sc.pp.scale(adata, max_value=10)sc.tl.pca(adata)sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=15, n_pcs=30)sc.tl.leiden(adata, resolution=0.6)sc.tl.umap(adata)sc.pl.umap(adata, color=["leiden", "CD3D", "MS4A1", "LYZ"])

多样本整合：不要把批次效应当成生物学发现

单细胞数据最常见的坑，是不同样本、不同批次、不同平台的技术差异被误认为真实细胞差异。Python 里常用两类路线：一种是传统嵌入校正，如 Harmony、BBKNN；另一种是概率深度模型，如 scVI。scVI 的优势是能把批次信息放进生成模型中，用潜在空间表示细胞状态，适合多样本、多批次、大数据整合。

·小数据、快速探索：Scanpy + Harmony/BBKNN 往往够用。

·多批次、多中心、上万到百万细胞：优先考虑 scVI。

·有标签细胞类型：可进一步用 scANVI 做半监督注释和整合。

·整合后一定检查：每个样本是否混合合理，关键细胞类型是否被过度融合。

import scviscvi.model.SCVI.setup_anndata(adata, batch_key="sample")model = scvi.model.SCVI(adata, n_latent=30)model.train()adata.obsm["X_scVI"] = model.get_latent_representation()sc.pp.neighbors(adata, use_rep="X_scVI")sc.tl.umap(adata)sc.tl.leiden(adata)sc.pl.umap(adata, color=["sample", "leiden", "cell_type"])

可视化：图不是装饰，而是分析的证据链

轨迹分析：从细胞地图走向细胞故事

聚类告诉你“有哪些细胞群”，轨迹分析试图回答“这些细胞群可能如何变化”。PAGA 适合先看全局拓扑结构，Palantir 更强调分化命运概率和伪时间，RNA velocity/scVelo 则利用未剪接和已剪接 RNA 的比例估计细胞未来方向。

·PAGA：适合粗略判断细胞群之间的连接关系，常用于给 UMAP 布局提供拓扑约束。

·Palantir：适合连续分化过程，输出伪时间、分支概率、终末状态概率。

·RNA velocity/scVelo：适合有 spliced/unspliced 信息的数据，能推断细胞状态变化方向。

·关键提醒：轨迹不是时间机器，它是基于转录相似性和模型假设推断出的可能路径。

细胞通讯：CellPhoneDB 帮你从细胞群走向微环境

在肿瘤免疫、炎症、发育和组织微环境研究中，细胞通讯分析很容易成为文章亮点。CellPhoneDB 会基于配体-受体数据库，判断哪些细胞群之间存在潜在信号互作。Python 工作流里，常见做法是先用 Scanpy 得到细胞注释和表达矩阵，再导出给 CellPhoneDB。

·输入：表达矩阵 + 每个细胞的细胞类型标签。

·输出：细胞群之间显著的 ligand-receptor pairs。

·适合讲故事：肿瘤细胞如何影响免疫细胞，成纤维细胞如何塑造微环境。

·限制：配体-受体共表达不等于真实通讯，最好结合空间转录组、蛋白验证或功能实验。

基因共表达/调控网络：从 marker gene 走向调控因子

单细胞论文如果只停在 marker 基因，很容易显得浅。网络分析能进一步回答：哪些转录因子可能驱动细胞状态？哪些基因形成模块？哪些 regulon 在某类细胞中特异激活？pySCENIC 是 Python 生态中常见的调控网络工具，可推断 TF-target 关系和 regulon 活性。

·pySCENIC：从表达矩阵推断共表达模块，再结合 motif 数据筛选可能的 TF regulon。

·WGCNA 思路：按基因共表达构建模块，再关联细胞类型、疾病状态或评分。

·输出重点：不要只列网络图，最好提炼出关键 TF、靶基因模块和生物学机制。

CNV 分析：肿瘤单细胞里最容易出亮点的一步

肿瘤单细胞分析常常需要区分恶性细胞和非恶性细胞。infercnvpy 可以在 Python 中参考 inferCNV 思路，通过染色体位置上的表达偏移推断拷贝数变异。CopyKAT 是常用的 R 工具，能推断肿瘤细胞的 aneuploidy 和 CNV 模式；如果坚持 Python 主流程，可以把 AnnData 导出表达矩阵后调用 R 脚本运行 CopyKAT，再把结果写回 .obs。

·适用场景：肿瘤组织、恶性细胞识别、肿瘤亚克隆探索。

·必要前提：有比较可靠的正常参考细胞，或工具能自动估计 diploid 细胞。

·结果解释：CNV 推断是表达层面的近似，不等同于 DNA 测序确认的 CNV。

AI 在单细胞中的应用：不是炫技，而是解决三个问题